La microscopie électronique est développée à partir d’un ensemble de techniques et d’équipements qui permettent d’imager, à partir de faisceaux d’électrons ,le contenu intra-cellulaire d’échantillons (coupes ultrafines en microscopie électronique à transmission) ou l’extrême surface d’échantillons (microscopie électronique à balayage) avec une haute à très haute résolution (pouvoir séparateur de quelques dizaines de nanomètres pouvant atteindre 0.1 nm) .
Les observations impérativement réalisées dans un environnement à très faible pression (10-3-10-4 Pa) impliquent dans une grande partie de nos cas d’étude ( échantillons biologiques) des conditionnements et préparations d’échantillons souvent importantes et parfois drastiques pour gérer notamment le contenu en eau et la conduction des échantillons au courant du faisceau .
Les nouvelles générations de microscopes électroniques (pression contrôlée) et l’emploi de cryo techniques éprouvées dans les enceintes des microscopes permettent des observations d’échantillons biologiques « sans préparations » ou des observations en mode cryo-génique (échantillon congelé et gardé tel quel sous un vide poussé et à une température de -140°C dans la chambre du microscope).
Soumise aux faisceaux électroniques ou de rayons X la matière ré-emet par fluorescence des photons qui sont caractéristiques en Energie et en Longueur d’onde des transitions atomiques et donc des atomes d’interaction. A partir de ce principe la collection et le comptage de ces photons à l’aide de spectromètres placés en détection sur l’enceinte des microscopes permet la qualification et dans des conditions strictes de type et de préparation d’échantillons la quantification des éléments chimiques composant cette matière à l’échelle du grandissement d’observation (microanalyses EDS-WDS. EDX dans le cas d’irradiation des échantillons avec un rayonnement X).
Microscope Electronique à balayage à Emission Tungstène
Modèle : LEO (Zeiss) 1452VP
Caractéristiques :
> Microscopie Electronique à Balayage
> Imagerie en pression contrôlée
> Micro-Analyses EDS ,WDS,EDX
Cet appareil permet d’imager avec une très bonne résolution un très grand nombre et type de surfaces d’échantillons à partir d’un canon d’émission à filament de tungstène. Il peut fonctionner en mode pression contrôlée (1-133Pa) afin d’éviter toute préparation (séchage, métallisation,…) avant l’acquisition d’images numériques. Les signaux électroniques issus du balayage du faisceau primaire avec la surface de l’échantillon sont collectés par 3 détecteurs spécifiques et traités par une chaine numérique à haute performance , imagerie directe sur écran, synchrone avec le balayage faisceau:
> Détecteur d’Electrons Secondaires à haute résolution de la surface type Everhart-Thornley (acquisitions exclusivement en mode vide poussé).
> Détecteur d’Electrons Rétrodiffusés(4 secteurs silice) :contraste chimique+contraste topographique à l’acquisition .(fonctionnement dans les 2 modes de vide , vide poussé et vide dégradé).
> Détecteur d’Electrons Secondaires en mode vide dégradé (pression contrôlée) .Imagerie de surface en mode pression contrôlée.
L’utilisation optimale de l’appareil en mode pression contrôlée peut nécessiter de refroidir des échantillons partiellement hydratés (<40% d’eau) afin de conserver durablement cette eau (glace) dans les tissus et permettre de les imager directement sous vide dégradé. Pour cela, ce microscope est équipé d’un support échantillon refroidi (ou chauffé) par effet Peltier (Platine effet Peltier DEBEN -50°C ;+50°C).
Micro-Analyses EDS ,WDS,EDX
Les applications de recherche développées sur ce microscope sont en grande partie réalisées grâce à la micro-analyse X des surfaces balayées.
Sur 2 ports de la chambre de l’appareil sont implantés deux spectromètres de rayons X spécifiques de la collection et du comptage de photons issus de l’interaction électron –matière dans le MEB (Fluorescence X) :
> Spectromètre SDD (Sillicon Drift Detector) XMAX 80mm² (Oxford instruments)
Détection en Sélection d’Energie (EDS) des photons issus des transitions énergétiques au sein des atomes composant la matière (gamme spectrale de détection du Bore à l’Uranium)
Acquisition de spectres en continu sur l’ensemble de l’échelle des énergies.
> Spectromètre INCA WAVE (Oxford Instruments)
Détection en Dispersion de Longueur D’onde (WDS) des photons issus des transitions énergétiques au sein des atomes .Acquisition à haute résolution , grande sensibilité et faible seuil de détection, de pics dans la longueur d’onde d’émission des photons (émission lors de la transition énergétique par un seul atome sélectionné) .
Principe de mesure (diffraction des rayons X sur cercle de Rowland) basé sur une focalisation du rayonnement photonique avec un cristal monochromateur (diffraction) et un compteur proportionnel (comptage des rayonX diffractés dans l’exacte longueur d’onde d’émission par l’atome d’intêret) .
> Logiciel de gestion des micro-analyses EDS+WDS INCA ENRGY+ (Oxford Instruments)
L’interface installée propose l’acquisition (acquisition simultanée EDS+WDS possible) EDS et WDS et le traitement des spectres (déconvolution spectrale et calcul de titres massiques) selon différentes ‘suites’ logicielles intégrées qui optimisent la sélection de zones d’intérêt (prise en main du MEB par INCA), permettent la cartographie élémentaire (répartition des éléments sur la surface balayée), l’automatisation de ces tâches d’acquisition (routines macro-programmées),et la détection par seuillage de signal et la micro-analyse élémentaire (EDS) de particules (interface feature issue des GSR de la police scientifique).
> Génerateur de rayons X guidés par optique polycapillaire ( ‘focalisation’ des rayons X) iMOXS (lfG GmbH Modular X-ray Source).
Ce générateur de rayons X (tube rhodium) guidés par fibres optiques polycapillaires adapté directement sur la chambre du MEB permet d’irradier les surfaces imagées (en coïncidence avec le faisceau électronique) avec un spot de rayons X de diamètre relativement petit (100-150 µm) et de collecter les photons issus de la fluorescence X d’un volume important de l’échantillon avec le spectromètre en sélection d’énergie (µanalyse EDX en volume).
Les propriétés physicochimiques de ces interactions sont différentes de celles engendrées par un rayonnement électronique primaire : intégration dans le volume de l’échantillon, diminution du bruit de fond matrice (amélioration de la détection et de la déconvolution spectrale) , réduction de la gamme spectrale d’investigation (magnésium-uranium), analyse réduite en résolution spatiale (taille du spot).
Microscope Electronique à Emission de Champ
Modèle : CRYO-MEB-FEG (Zeiss, Oxford Instruments, Leica)
Caractéristiques :
> Microscopie Electronique à Balayage
> Imagerie à très haute résolution
> Imagerie en pression contrôlée
> Cryo-microscopie
> Microscopie corrélative
> Microscopie à transmission
Ce microscope est équipé de :
> détecteurs d’électrons pour l’imagerie dans les deux modes (électrons rétrodiffusés, électrons secondaires en mode pression contrôlée, électrons secondaires en mode vide secondaire)
> détecteur haute résolution Inlens
> détecteur d’électrons en transmission (STEM)
> spectromètres d'analyse des rayons X à sélection d'énergie (EDS-SDD 80mm2)
> module de cryopréparation et cryoobservation (-120 °C), platine à effet Peltier (-50°C/+50°C)
Cet équipement est dédié à la réalisation d’observations à haute résolution et basse tension de l’extrême surface d’échantillons biologiques essentiellement végétaux dans de multiples modes (pression contrôlée, vide secondaire, imagerie en transmission, imagerie haute résolution d’échantillons cryo-fixés…) avec possibilité de micro-analyses X (cartographies élémentaires).
Un module et une interface graphique intégrés permettent la réalisation d’observations et d’images corrélées avec d’autres images et sites d’intérêts acquis à partir d’autres appareillages (microscope laser confocal…).
D’autres développements internes permettent la mise en relation précise d’observations réalisées à différentes échelles : Scanner graphique/ Imagerie photonique/Imagerie électronique.
Un détecteur spécifique intégré dans le FEG permet l’observation en balayage (STEM) de coupes anatomiques ultrafines disposées sur des grilles de microscopie électronique en transmission.
Contact
Responsable du pôle : Christophe Rose Christophe.rose@inrae.fr
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