Plateau de préparation microscopie électronique

Différents appareils permettent d’améliorer l’état de surface des échantillons qui parviennent sur la plateforme (échantillons en grande majorité biologiques et à l’état « brut » ) et de les préparer au mieux pour des observations et analyses avec les MEB.

Appareils permettant le surfaçage et la coupe fine des échantillons biologiques :

Vibratome :

Permet la réalisation de coupes fines ou le surfaçage d’échantillons "mous" (feuilles, racines…). Les échantillons sont inclus dans un medium (agar-agar) qui maintient et présente la surface à trancher dans une position adéquate.

Une lame de rasoir réglée en angle et en contact avec la surface se déplace (déplacements paramétrés)  en vibrant (fréquence ajustable) et "tranche" l’échantillon en coupes fines : à chaque répétition de coupe le support échantillon se déplace verticalement (ajustable) de la hauteur de coupe voulue (quelques microns) pour le contact avec la lame.

Les coupes dans des échantillons de bois sont limitées par la rigidité trop importante du matériau (petits rameaux seulement).

Microtomes :

Pour plus d'informations sur les microtomes, vous pouvez consulter l'article "Plateau de préparation microscopie histologique".

Microtome à glissière dédié au bois :

Cet appareil équipé de mors de différents profils permet de serrer des segments de carottes prélevées dans l’arbre avant de déplacer un couteau (lame jetable) ajusté en angles (inclinaison et angle d’attaque) à la surface du segment (coupes micrométriques et surfaçage) .La hauteur de coupe est ajustée à chaque passage par un déplacement vertical (roue à déplacements micrométriques) de la platine porte–échantillon vers le couteau.

Microtome dédié aux carottes de bois :

Cet appareil dérivé du premier permet selon les mêmes principes de fonctionnement de surfacer (dendrométrie, dendrochimie…) ou de réaliser des coupes sur une carotte entière (plusieurs dizaines de cm).

Ces appareils ont été développés par le WSL en Suisse :

https://www.youtube.com/watch?v=c2N-cBV_lSg

Cryo-microtome ou cryostat (Leica CM3050S) :

Le principe de coupe de cet appareil très fréquemment utilisé en biologie est similaire à celui évoqué précédemment : passage d’un couteau (lame jetable) positionné en angle d’attaque et inclinaison à la surface de l’échantillon.

Dans cet équipement le déplacement de l’échantillon au contact du couteau (hauteur de coupe) peut être manuel (roue ou volant) ou motorisé (passages et coupes  en série)

L’échantillon biologique "mou" est rigidifié et maintenu par inclusion dans un médium qui polymérise au froid (-10°C Tissue tek ®…), le porte échantillon et le porte lame peuvent être refroidis et maintenus jusqu’à -30°C.

Lyophilisateur à plateaux refroidis et pression contrôlée

FreeZone 6liter Benchtop Labconco FreeZone, Stoppering TraysDryers 3shelves

Avant les observations ou analyses sous vide intense (10-4 Pa) au MEB, les échantillons hydratés doivent soient être congelés et introduits dans la chambre du MEB par un sas cryogénique et sur une platine cryo-réfroidie (-140°C) ou déshydratés afin de permettre des observations de surface à fort grandissement et haute résolution. Le séchage à l’air des échantillons engendre majoritairement trop d’artefacts ou de déformations de l’échantillon pour pouvoir l’observer convenablement.

Le principe et les techniques de lyophilisation sont développées depuis longtemps sur la plateforme : limitation des déformations engendrées par le séchage des échantillons bruts (carottes de bois,rondelles…), immobilisation au sein des tissus des éléments minéraux d’intérêt pour la micro-analyse…).

Cet appareil permet d’extraire l’eau (glace) lentement et de manière contrôlée (ajustement de la pression dans la chambre jusqu’à plusieurs centaines de Pa). Les échantillons  congelés sont placés sous vide, sur des plateaux refroidis (température ajustable et programmable dans le temps).

La sublimation de la glace s’opère en différentes phases contrôlées par l’ajustement de la température des plateaux et les rampes de remontée en température :

> La lyophilisation primaire : sublimation rapide des cristaux de glace en surface de l’échantillon et eau libre (glace) dans l’échantillon est principalement réalisée dans les premières heures de mise sous vide avec maintien des plateaux au froid (non altération des composés organiques).

> La lyophilisation secondaire est beaucoup plus progressive et dépend de l’échantillon et de la quantité d’eau "liée" faisant partie de la composition même des tissus. Durant cette phase le réchauffement partiel des plateaux selon des rampes de températures et stades de maintien à température constante permet d’extraire par sublimation lente cette eau liée.

> La dernière phase consiste à faire remonter la température dans la chambre du lyophilisateur à une valeur égal ou légèrement supérieure à la température ambiante de manière à éviter totue reprise d’eau (hygromètrie ambiante) lors de l’ouverture après remise à pression atmosphérique du dispositif.